2018年1月，當兩個萌萌的體細胞克隆猴寶寶“中中”和“華華”第一次在公眾面前亮相時，科研人員就曾預言，中國將率先建立起可有效模擬人類疾病的克隆猴模型，其既能滿足腦疾病和腦高級認知功能研究的迫切需要，又可廣泛應用于新藥研發(fā)。
　　僅僅在一年之后，這個預言便成為了現(xiàn)實。


　　1月22日，在中科院神經(jīng)科學研究所非人靈長類研究平臺保育室，工作人員在給生物節(jié)律紊亂體細胞克隆猴喂食。新華社記者 金立旺 攝
　　1月23日，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心研究團隊對外宣布，通過體細胞克隆技術，成功獲得了五只BMAL1基因敲除的克隆猴。這是國際上首次成功構建一批遺傳背景一致的生物節(jié)律紊亂獼猴模型，意味著克隆基因編輯猴技術由此從理論層面邁向了實踐層面，中國正式開啟了批量化、標準化創(chuàng)建疾病克隆猴模型的新時代。
　　該成果于北京時間1月24日在線發(fā)表于中國頂級英文期刊《國家科學評論》。




　　非靈長類動物與人類高度相似，是研究節(jié)律紊亂相關疾病的理想動物模型
　　雄雞報曉、蜘蛛半夜結網(wǎng)，向日葵在清晨開放……自然界中所有生物大都擁有按時間節(jié)奏調節(jié)自身活動的本領，我們稱之為生物節(jié)律，也就是通常所說的生物鐘。
　　研究表明，生物節(jié)律系統(tǒng)在維持機體內在的生理功能，如睡眠、體溫、代謝和器官功能等，以及適應環(huán)境的變化方面扮演著重要角色。生物節(jié)律紊亂與睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默?。⒕耦惣膊。ㄈ缫钟舭Y）、糖尿病、腫瘤、以及心血管等疾病密切相關。
　　傳統(tǒng)模式的小鼠和果蠅等動物模型因其與人的晝夜活動周期、腦結構和代謝速率等存在明顯差異，極大地制約了生物節(jié)律紊亂機理研究和相關疾病治療手段的研發(fā)。因此，亟需建立更為理想的動物模型。
　　中國科學院神經(jīng)科學研究所所長、腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心蒲慕明院士說：“非人靈長類動物在結構和功能活動等很多方面都與人類高度相似，是研究節(jié)律紊亂相關疾病機理和診治手段比較理想的動物模型。”
　　然而，一直以來對非人靈長類動物的基因編輯非常困難，直到新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9發(fā)明。
　　2015年底，研究團隊嘗試利用CRISPR/Cas9技術，敲除了猴胚胎中的生物節(jié)律核心基因BMAL1，產(chǎn)生了一批生物節(jié)律核心基因BMAL1缺失的獼猴。
　　“在哺乳動物的大腦中，有一個控制生物節(jié)律的‘起搏器’，他就是位于下丘腦的視交叉上核。如果將他損毀，動物的晝夜節(jié)律就會完全消失?！毖芯繄F隊成員、神經(jīng)科學研究所生物節(jié)律與衰老疾病研究組組長張洪鈞研究員說，“這個起搏器平常一般是通過一系列節(jié)律基因來調控晝夜節(jié)律的，BMAL1便是這些核心節(jié)律基因中的一個?！?br>　　那么，這些被敲除掉BMAL1基因的獼猴是否會表現(xiàn)出節(jié)律紊亂的癥狀呢？
　　等到半年后小猴們斷奶，研究人員開始從多個方面進行觀察。結果，他們發(fā)現(xiàn)敲除猴不再按照24小時的周期活動，在夜間活動明顯增多。此外，這些敲除猴的大多數(shù)節(jié)律基因表達異常，還有很多與睡眠剝奪，抑郁癥以及衰老等相關的基因上調。
　　張洪鈞說：“我們可以明顯看出敲除猴表現(xiàn)出怕人。比如，當保育員靠近時，它會雙手抱住頭部，蜷縮在角落里，不敢活動。這些癥狀是以前在小鼠身上很難觀察到的?！?br>　　基于此，研究團隊最終確定，成功構建了世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除食蟹猴模型。


　　五只生物節(jié)律紊亂體細胞克隆猴（2018年11月27日攝）。新華社發(fā)（中科院神經(jīng)科學研究院供圖）


　　利用基因編輯的細胞進行核移植是批量制備基因修飾猴模型的首選方法
　　核心節(jié)律基因BMAL1敲除食蟹猴模型的成功構建，為模擬人的節(jié)律紊亂相關疾病邁出了關鍵的一步。但是，它還并不能作為理想的動物模型。
　　張洪鈞說：“通過基因敲除方法獲得的第一代模型猴個體間存在遺傳背景和基因編輯嵌合率差異，也就是其中有個體的BMAL1并未被完全敲除，所以表現(xiàn)出的生物節(jié)律紊亂癥狀的嚴重程度不一致?！?br>　　如何解決這個問題呢？
　　“個體差異大，對實驗干擾就會比較大。”蒲慕明認為理想的基因修飾猴模型應該是背景相同且無嵌合，而利用基因編輯的細胞進行核移植是批量制備基因修飾猴模型的首選方法。
　　為此，研究團隊在此基礎上，采集了一只BMAL1基因敲除徹底，且睡眠紊亂癥狀最明顯的獼猴的體細胞，通過之前掌握的體細胞克隆技術，成功獲得了五只BMAL1基因敲除的克隆猴。
　　之后，為了確認是否克隆成功，研究人員仔細檢測了這些克隆猴的細胞核基因型和線粒體基因型。
　　研究團隊成員、神經(jīng)科學研究所非靈長類研究平臺主任孫強研究員說：“經(jīng)過檢測，這五只小猴的細胞核基因型與核供體細胞完全一致，而線粒體基因型則與卵供體猴一模一樣，同時它們的所有基因與生出它們的代孕媽媽則徹底無關，完全符合克隆動物的鑒定金標準。”
　　值得一提的是，去年克隆“中中”和“華華”所使用的體細胞來自流產(chǎn)猴胚胎，而這次采用的是成年活體基因編輯猴的體細胞。
　　“克隆的成功率與作為核供體的細胞有很大的關系。”研究團隊成員、神經(jīng)科學研究所靈長類生殖工程研究組組長劉真研究員說，通常，細胞和人一樣會在生長繁殖的過程中逐漸衰老，隨著細胞不斷分裂，會積累越來越多的DNA突變，細胞核的質量也會逐漸下降。所以，越年長的猴子，其體細胞活力就越弱，克隆難度就增大，成功率也可能隨之降低。
　　但令科研人員沒想到的是，當他們在對這個經(jīng)過編輯攜帶疾病基因的成年活體獼猴體細胞進行細胞核移植時，發(fā)現(xiàn)比想象中的效率要高。
　　劉真說：“但這個現(xiàn)象是發(fā)生在特定細胞條件下，數(shù)量又少，是不是一個普遍規(guī)律還有待進一步研究?！?br>

　　1月23日，在上海松江G60腦智科創(chuàng)基地舉行的新聞發(fā)布會上，中科院神經(jīng)科學研究所所長蒲慕明院士、張洪鈞研究員、孫強研究員、劉真研究員（從左至右）在回答記者提問。新華社記者金立旺攝


　　將為人類重大腦疾病的機理研究、早期診斷、以及藥物研發(fā)帶來了前所未有的光明前景
　　相較去年“中中”和“華華”的克隆成功，此次利用體細胞克隆技術制作腦疾病模型猴意義更為重大，意味著克隆基因編輯猴技術由此從理論層面邁向了實踐層面。
　　孫強說：“‘中中’和‘華華’本質上都還屬于未經(jīng)過基因編輯的野生型猴子。而此次這五只BMAL1基因敲除的克隆猴是疾病模型猴，是真正意義上能夠廣泛被應用的新型高效的動物模型，將為人類社會面臨的重大腦疾病的機理研究、早期診斷與干預、以及藥物研發(fā)帶來前所未有的光明前景?！?br>　　國際權威專家評價：“這項研究首次證實通過體細胞核移植技術可以克隆成年基因修飾猴。這為在短期內生產(chǎn)一批無嵌合體的基因修飾猴提供了一個完美的解決方案。這樣的克隆猴模型對人類疾病研究有重要價值?！?br>　　蒲慕明認為，該成果還有助于縮短藥物研發(fā)周期，提高藥物研發(fā)成功率，解決腦疾病機理研究和藥物研發(fā)中的“卡脖子”問題，必將極大地促進生命科學和醫(yī)學的發(fā)展，有力推動我國新藥創(chuàng)制與研發(fā)。
　　對于公眾所高度關注的克隆、基因編輯等技術所涉及的倫理問題，蒲慕明明確表示，中科院做這項工作的目的，是為提高人類健康、研究腦科學基本問題服務的，而且嚴格遵守了國際各項相關協(xié)議和規(guī)則。
　　相反，這項工作還可能使一些倫理爭議得到化解。
　　目前，全世界每年對獼猴的使用量高達10萬只，主要被用于藥物篩選實驗。利用體細胞克隆猴技術，人們就能使用體細胞在體外有效地做基因編輯，準確地篩選基因型相同的體細胞，產(chǎn)生基因型完全相同的大批胚胎，用母猴載體懷孕出生一批基因編輯和遺傳背景相同的猴群。
　　蒲慕明說：“體細胞克隆猴技術讓人們在一年內就能制備大批遺傳背景相同的模型猴，大大減少了個體差異對實驗的干擾。這樣，只要使用很少數(shù)量的克隆猴，就能夠完成很有效的篩選。這次獲取的五只生物節(jié)律紊亂體細胞克隆猴模型，就是非常成功的實踐。”
　　蒲慕明也同時表示，鑒于目前克隆技術是制造遺傳背景一致的基因編輯猴的成本最低、耗時最少的手段，而作為全球暫時唯一掌握克隆技術的中科院神經(jīng)科學研究所，有望在未來的神經(jīng)科學研究中搶先一步。








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